Криоэлектронная микроскопия использована для выявления структурных изменений, которые временно отключают синтез РНК

Исследователи выяснили механизм приостановления транскрипции у некоторых бактерий, определив структуры РНК-полимеразы в комплексе с шаблоном ДНК, продуктом РНК и белковым фактором с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).

Рисунок: Цикл присоединения нуклеотидов бактериальной РНК-полимеразы (RNAP) изображен с помощью мультипликационных моделей шаблонной ДНК (tDNA, зеленый), РНК (RNA, красный), триггерной петли (TL, пурпурный), брусковой спирали (BH, синий), входного NTP (красный) и Mg2+ (желтые сферы) вместе с конформационными изменениями RNAP (поворот, складывание триггерной петли), связанными с каждым шагом цикла присоединения нуклеотидов. Взаимодействие NusG и нешаблонной ДНК (ntDNA, светло-зеленый) (центральная панель) ингибирует поворот РНК-полимеразы, складывание триггерной петли аллостерично, тем самым прекращается синтез РНК. Credit: Proceedings of the National Academy of Sciences (2023). DOI: 10.1073/pnas.2218516120

Точный контроль экспрессии генов - обеспечение того, чтобы клетки производили нужные компоненты в нужном количестве и в нужное время - жизненно важен для нормального функционирования всех организмов. Клетки должны регулировать, как гены, закодированные в последовательности ДНК, превращаются в молекулы РНК, которые могут выполнять клеточные функции самостоятельно или быть далее переработаны в белки.

Одним из способов регуляции экспрессии генов является приостановление "транскрипции" - процесса, во время которого РНК синтезируется из шаблона ДНК ферментом, называемым РНК-полимеразой. Теперь исследователи выяснили механизм приостановки транскрипции у некоторых бактерий с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), позволяющей определить в атомном масштабе структуру РНК-полимеразы до, во время и сразу после паузы в производстве РНК. Выяснение механизма приостановления транскрипции имеет решающее значение для понимания основных клеточных функций, рассказывают в Пенсильванском государственном университете.

Одним из ключевых компонентов приостановления транскрипции у бактерий является белковый фактор под названием NusG, который сохраняется во всех организмах, включая человека, поэтому, как отмечают авторы исследования, обнаруженный в данной работе механизм приостановления может быть широко применен для понимания регуляции генов во всех организмах на Земле. Полученные данные также могут быть использованы для выявления новых антибактериальных агентов, которые нацелены на приостановление транскрипции и ингибируют ее, нарушая тем самым правильную экспрессию генов и клеточные функции.

Статья, описывающая исследование, была опубликована 6 февраля в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences ("Труды Национальной академии наук").

Также интересно: ученые обнаружили ген деэскалации агрессии, но пока только у плодовых мушек.

"Для нормального функционирования, клетки должны точно контролировать экспрессию генов, чтобы гарантировать, что они производят выбранные белки и функциональные РНК в нужном количестве и в нужное время", - говорит Кастухико Мураками, профессор биохимии и молекулярной биологии, один из руководителей исследовательской группы.

"Экспрессия генов может регулироваться множеством способов, даже когда РНК-полимераза активно продуцирует РНК, например, приостановлением транскрипции. Здесь мы использовали крио-ЭМ определения структуры и биохимические анализы на основе структуры, чтобы определить взаимодействия между РНК-полимеразой, ДНК и NusG, а также структурные изменения РНК-полимеразы, которые происходят, когда РНК-полимераза делает паузу во время транскрипции", - указал профессор Мураками.

РНК-полимераза - это молекулярная машина, состоящая из нескольких функциональных доменов. Она также взаимодействует с рядом других белковых кофакторов, которые помогают регулировать время и количество производимой РНК. Работа в лаборатории Пола Бабицке, профессора молекулярной биологии и руководителя исследовательской группы, показала, что один из этих кофакторов, белок под названием NusG, имеет решающее значение для приостановления транскрипции.

"Мы экспериментально показали, что NusG играет важную роль в приостановлении транскрипции, распознавая специфический мотив короткой последовательности ДНК", - говорит Бабицке.

"Мы обнаружили более 1600 таких мотивов последовательности в геноме бактерии Bacillus subtilis, которые участвуют в NusG-зависимом приостановлении транскрипции. ДНК является двухцепочечной, и только одна нить, называемая нитью шаблона, транскрибируется в РНК. Интересно, что распознавательный мотив для NusG расположен на нешаблонной нити. Чтобы понять, как взаимодействие NusG с нешаблонной ДНК может привести к паузе, мы хотели посмотреть, что может происходить со структурой комплекса. Крио-ЭМ позволила нам сделать именно это", - рассказал он.

Исследовательская группа определила последовательности ДНК и РНК, которые вызывают приостановление транскрипции в присутствии NusG, а затем восстановила транскрипционный комплекс, используя ДНК, РНК и NusG вместе с РНК-полимеразой. Образцы были заморожены, а затем использованы для структурных исследований методом крио-ЭМ с помощью современной установки криоэлектронной микроскопии в Институте наук о жизни им. Хака при Пенсильванском университете.

В структуре приостановленного транскрипционного комплекса команда обнаружила, что NusG взаимодействует с нешаблонной нитью ДНК, вставляя ее в узкую полость между NusG и доменом РНК-полимеразы, так называемой бета-долей. Но это взаимодействие происходит далеко от активного сайта РНК-полимеразы, так как же оно приводит к приостановке транскрипции? Для решения этого вопроса исследовательская группа использовала уникальную информацию, полученную во время крио-ЭМ структурного исследования.

"Когда мы замораживаем образец, восстановленные транскрипционные комплексы могут находиться на разных стадиях процесса транскрипции", - говорит Риши К. Вишвакарма, ассистент профессора биохимии и молекулярной биологии Пенсильванского университета и первый автор статьи. "С помощью крио-ЭМ мы можем использовать данные одного образца для определения серии структур, показывающих различные стадии паузы в транскрипции, а затем последовательно расположить эти структуры. Мы использовали их для реконструкции фильма о транскрипционных комплексах, чтобы наблюдать, что происходит с транскрипционным комплексом, когда транскрипция приостанавливается, подобно тому, как перекидной календарь может представить движение из серии неподвижных изображений."

"Потребовалось некоторое время, чтобы выяснить, как взаимодействие NusG и нешаблонной ДНК приостанавливает транскрипцию", - говорит Мураками.

Он рассказывает: "Однажды, когда я смотрел фильм о транскрипционных комплексах, определенных в этой работе, я заметил, что большое конформационное изменение РНК-полимеразы - вращение поворотного модуля - связано со свертыванием петли, необходимым конформационным изменением РНК-полимеразы для синтеза РНК. Когда нешаблонная ДНК оказывается в ловушке между NusG и бета-частицей РНК-полимеразы, она препятствует вращению поворотного модуля, тем самым мешая свертыванию триггерной петли и синтезу РНК, как будто что-то застряло в одной из шестерен двигателя, что повлияло бы на другие части двигателя и остановило бы машину. Я был очень взволнован этой находкой и не мог перестать смотреть фильм, пока мои идеи укреплялись".

Поскольку приостановление транскрипции является временным механизмом остановки синтеза РНК, команда также изучила структурные изменения транскрипционного комплекса во время выхода из паузы, приготовив образец, содержащий приостановленный транскрипционный комплекс и субстрат РНК-полимеразы (NTP), и определив крио-ЭМ структуры.

В транскрипционном комплексе, вышедшем из паузы, нешаблонная ДНК больше не была зажата между NusG и бета-частицей РНК-полимеразы, что позволило поворотному модулю снова вращаться так, чтобы триггерная петля могла складываться правильно.

"Поскольку большинство компонентов этого процесса сохранились от бактерий до человека, нам интересно узнать, сохранился ли механизм", - говорит Мураками.

Он добавил, что продолжается работа с другими клеточными РНК-полимеразами, в частности, из архей и эукариот.

українською мовою